撰文 | 返樸

北京時間10月7日晚,2020年諾貝爾化學獎頒給瞭Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna,以表彰其在基因編輯方面作出的貢獻。

獲獎人簡介:

Emmanuelle Charpentier博士,法籍微生物學傢,現為德國馬克斯·普朗克研究所感染生物學研究所所長。在CRISPR的發展中,其主要的貢獻在於發現Cas9蛋白的活性仰賴tracrRNA。

Jennifer A. Doudna博士,為伯克利大學化學和分子生物學與細胞生物學教授,霍華德休斯醫學研究所的研究員,美國國傢科學院院士。她與Emmanuelle Charpentier博士共同發現Cas9 的切割作用和,crRNA 的定位作用,並將crRNA與tracrRNA可以融合成單鏈引導RNA(sgRNA)。

相關領域專傢分析稱,華人科學傢張鋒首先在真核細胞內采用CRISPR-Cas9實現基因編輯,但他未能獲獎,可能是因為張鋒的工作原創性要低一些,他的貢獻更像當初細胞重組中科恩和伯耶的貢獻(1980年化學獎當年人工重組給的是伯格);而且化學獎更註重體外實驗結果,他的突破主要體現在細胞方面。

CRISPR已經是目前生物醫學方面非常普及的的基因編輯技術,近幾年該技術的飛速發展,推廣應用到瞭生物、醫學、農業以及環境等多個領域,造就瞭一批批科研奇跡,尤其是在遺傳病的治療、疾病相關基因的篩查與檢測、腫瘤治療以及動植物的改造、病原微生物防治等領域有著巨大的潛力,也將深遠地影響整個世界。

  1. 什麼是CRISPRCRISPR的全稱是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,中文翻譯為“規律成簇的間隔短回文重復”。這個詞的字面意思就是“代表瞭同一類特征明顯、排列整齊、秩序一致的重復序列”。它作為細菌的適應性免疫系統,當外源病毒或質粒DNA進入細胞時,專門的Cas蛋白會將外源DNA剪成小片段,並將它們粘貼到自身的DNA片段中存儲。當再次遇到病毒入侵時,細菌能夠根據存儲的片段識別病毒,將病毒的DNA切斷而使之失效[1]。

科學傢利用CRISPR的這一功能,將其改造成為一種革命性的新型分子工具。由於它具有精準的定位和切割任何種類的遺傳物質的能力,使得科學傢能夠更得心應手地破解地球上任何生物 (包括人類) 的生命密碼。

  1. CRISPR 簡史

圖1:CRISPR發展簡史

CRISPR的發現與命名早在1987年,日本大阪大學的Nakata研究組在分析大腸桿菌時就發現,細菌中存在一些異常重復的序列[2]。但當時人們並不知道這些重復序列究竟有什麼作用,甚至還沒有正式為這些重復序列命名。直到20世紀80年代末,西班牙阿利坎特大學的Francisco Mojica再次在一種古菌種發現瞭類似的重復序列[3],這引起瞭他極大的興趣。在隨後的研究中,他一直在微生物中尋找類似結構,到2000年他已經在20多種不同的微生物種中發現瞭這一類似的序列[4]。2002年,荷蘭烏得勒支大學的Ruud Jansen發現不同物種的重復序列堿基數存在巨大差異,並且這種序列僅存在於原核生物中。為瞭更好地規范相關的研究,他們共同為這種重復序列命名為“CRISPR”。。多個CRISPR相關基因則被命名為Cas(CRISPR-associated)傢族[5]。

CRISPR-CAS系統的生物學作用2005年,CRISPR研究迎來瞭一個重要發現,兩個研究小組(Mojica和Pourcel)都觀察到瞭CRISPR重復序列之間的間隔序列並非來自於原核生物自身,而是來源於質粒或病毒[6-7]。因此,Mojica提出CRISPR是一種適應性免疫系統的假設。同年,Bolotin研究組在嗜熱鏈球菌中發現瞭Cas9,並預測這個龐大的蛋白質具有核酸酶活性。他們還發現與病毒同源的間隔序列都具有一種類似的尾巴,稱為PAM(protospacer adjacent motif)序列,它們對靶序列的識別至關重要。

受到這一假說的激發,當時還在著名的酸奶公司Danisco工作的法國微生物學傢Rodolphe Barragou決定對其進行驗證,以解決嗜熱鏈球菌爆發噬菌體感染死亡而影響酸奶生產的問題。2007年,他們通過實驗證明CRISPR系統確實是一種適應性免疫系統。嗜熱鏈球菌被病毒入侵後,整合瞭來自噬菌體基因組新的間隔序列,同樣的病毒再次入侵時細菌就有瞭抵抗攻擊能力[8]而Cas9蛋白可能是產生這種免疫能力所必需的。這是首次在實驗上證實瞭CRISPR-Cas是一種細菌獲得性免疫系統。

CRISPR-CAS的作用機制證實CRISPR-CAS生物學功能的證實,使得許多研究團隊認識到這一系統的重要性,隨後許多研究團隊紛紛開始補充CRISPR-Cas系統幹擾噬菌體機制的細節。2008年,John van der Oost研究小組在大腸桿菌中發現,來自噬菌體的間隔序列被轉錄成小RNA,成為CRISPR RNA(crRNA),並引導Cas蛋白到靶DNA上。Marraffini和Sontheimer在同年證明瞭CRISPR-Cas系統的目標分子是DNA,而不是RNA。他們還明確指出,如果將該系統轉移到非細菌系統中,可能成為一種強大的工具系統[9-10]。這為隨後的基因編輯埋下瞭伏筆。

2010年12月,Moineau團隊證明瞭CRISRP-Cas9在PAM序列上遊位置的精確切割使DNA雙鏈斷裂。而作為II型CRISPR系統的顯著特征,Cas9是切割唯一需要的蛋白,它與crRNAs共同介導CRISPR-Cas9的幹擾功能[11]。

2011年,Charpentier研究組對釀膿鏈球菌進行瞭小RNA測序,發現除瞭crRNA以外,還存在一種小RNA,稱為式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA通過24個核苷酸與crRNA中的重復序列互補配對與形成雙鏈,引導Cas9到靶DNA。至此,天然CRISPR-Cas9幹擾機制的拼圖基本拼搭完整[12]。

CRISPR-CAS基因編輯技術的出現2012年Charpentier和Doudna團隊合作,不僅證明Cas9具有切割DNA雙鏈的能力,還能夠將tracrRNA和crRNA鏈接成sgRNA(single guide RNA),並在體外實驗中證實瞭sgRNA也可以指導Cas9蛋白完成對DNA的雙鏈剪切。他們可以通過改變crRNA的序列控制Cas9的靶向位點[13]。隨後Siksnys團隊也報告瞭相同的發現。這一發現不僅是細菌獲得性免疫系統領域的裡程碑,更開啟瞭CRISPR-CAS基因編輯技術的新篇章。很快,2013年初的多篇論文都將CRISPR-Cas系統成功地應用到瞭哺乳動物細胞中。其中,Church研究組設計瞭II型CRISPR-Cas系統,在人293T細胞、K562細胞以及誘導多能幹細胞中通過設計sgRNA成功靶向特定序列,且多個gRNA可以實現對目標基因的多重編輯[14]。張鋒實驗室證明瞭CRISPR-Cas9系統可以在人類和小鼠細胞中進行精確的定點切割,並且將Cas9突變為缺口酶,促進同源修復過程[15]。Qi研究組則建立瞭CRISPRi系統,還實現瞭多sgRNAs 靶向多基因 (Tet1、Tet2、Tet3、Sry 和Uty) 的同時定點突變[16]。Wu等人利用CRISPR-Cas9系統對Crygc 顯性突變的小鼠進行基因治療使其獲得瞭健康的後代,為CRISPR-Cas9 系統用於遺傳疾病的基因治療提供瞭依據[17]。

由此,CRISPR系統在多種生物的基因定點編輯、基因組篩選、基因轉錄調控、基因組成像、基因診療、生態應用等領域的研究與應用開始井噴。隨後幾年,張鋒實驗室更將CRISPR-CAS的基因編輯系統進行瞭拓展,不僅發現瞭在特異性和多基因編輯方面都有著很大優勢的CRISPR-Cas系統:CRISPR-Cpf1[18],還發現具有RNA酶功能的CRISPR酶Cas13a(C2c2)[19]和Cas13b[20]。2017年,有多篇文章研究瞭CRISPR-Cas13系統的作用機制、在臨床診斷中的應用以及在哺乳動物細胞靶向RNA的能力。

  1. CRISPR 基因編輯技術的應用CRISPR技術迅速發展使得它在轉化醫學和疾病治療領域中的應用不斷創造出驚喜。2015年Science雜志發表瞭成功使用CRISPR治療遺傳性疾病動物模型的方法。他們利用CRISPR系統編輯Dystrophin基因,能夠不同程度修復杜氏肌營養不良癥小鼠的肌肉功能,從而達到治療DMD的效果[21]。2018年有研究證實利用CRISPR技術成功治療瞭四隻患有DMD(Duchenne型肌營養不良癥)的狗,並將其肌肉和心臟組織中的營養不良蛋白恢復到正常水平的92%[22]。此外,CRISPR技術還與細胞免疫療法相結合以完善CAR-T療法,並在小鼠中增強瞭腫瘤抑制作用。首次利用CRISPR-Cas9在T細胞中敲除PD-1基因的臨床試驗已被批準用於治療肌肉浸潤性膀胱癌、去勢抵抗性前列腺癌、轉移性腎癌和轉移性非小細胞肺癌,並在2016年開始瞭I期臨床試驗[23]。
  2. CRISPR的其他應用目前,CRISPR 並不止在基因組編輯得到瞭應用,在基因檢測方面也展現瞭巨大的潛力。在2017年Science發表的研究中,Doudna 團隊發現瞭一個很有趣的現象:CRISPR 系統在剪切靶向的雙鏈 DNA 的同時,Cas12 的 DNA 酶活性會被激活[24]。這個發現為檢測細胞內是否含有某目的DNA 提供瞭一個全新的思路:同時向細胞內遞送靶向該 DNA 的 CRISPR-Cas12a 系統和非特異性 ssDNA 熒光報告基因(FQ-labeled reporter),一旦檢測到目的 DNA,CRISPR-Cas12a 系統將啟動,與此同時,熒光報告基因也會被降解,從而釋放出熒光信號。利用這一技術,Doudna 團隊開發瞭DETECTR系統,能夠在一小時內100%準確檢測出 HPV 16 感染,且單次測試成本不到一美元。與此同時,張鋒團隊也利用CRISPR-Cas13a開發出瞭SHERLOCK系統和SHERLOCKv2系統[25],與Doudna團隊不同,張鋒團隊設計的熒光報告基因必須是特異性,也正是“特異性”這個優點使得 SHERLOCKv2 可以同時檢測多種序列。張鋒團隊還開發瞭類似驗孕棒的試紙檢測方法,隻需一張試紙,SHERLOCKv2 就能顯示出病毒感染的檢測結果,這使得檢測更為便利。在今年COVID-19的檢測技術開發中,SHERLOCKv2也曾一顯身手。

雖然目前 DETECTR 和 SHERLOCK 已向我們展現出它們在診斷中的強大力量,但是在進入臨床使用前,為瞭確保診斷的準確性,研究者們仍然需要做大量的工作。我們相信這些新的診斷工具必將改寫未來的診斷技術,尤其是為那些衛生條件相對較差、病毒高發的發展中國傢在病毒感染診斷上帶來巨大的幫助。。

參考文獻

1. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov 28;346(6213):1258096. doi: 10.1126/science.1258096. PMID: 25430774..

2. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol. 1987 Dec;169(12):5429-33. doi: 10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987. PMID: 3316184; PMCID: PMC213968.

3. Lander ES. The Heroes of CRISPR. Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):18-28. doi: 10.1016/j.cell.2015.12.041. PMID: 26771483.

4. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol Microbiol. 2000 Apr;36(1):244-6. doi: 10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x. PMID: 10760181.

5. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 2002 Mar;43(6):1565-75. doi: 10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. PMID: 11952905.

6. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 2005 Feb;60(2):174-82. doi: 10.1007/s00239-004-0046-3. PMID: 15791728.

7. Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 2005 Mar;151(Pt 3):653-663. doi: 10.1099/mic.0.27437-0. PMID: 15758212.

POURCEL C,SALVIGNOL G,VERGNAUD G.CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA,and provide additional tools for evolutionary studies[J】.Microbiology,2005,15l(3):653—663.

8. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007 Mar 23;315(5819):1709-12. doi: 10.1126/science.1138140. PMID: 17379808.

9. Marraffini LA, Sontheimer EJ. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 2008 Dec 19;322(5909):1843-5. doi: 10.1126/science.1165771. PMID: 19095942; PMCID: PMC2695655.

10. Abbott A. The quiet revolutionary: How the co-discovery of CRISPR explosively changed Emmanuelle Charpentier’s life. Nature. 2016 Apr 28;532(7600):432-4. doi: 10.1038/532432a. PMID: 27121823.

11. Garneau JE, Dupuis MÈ, Villion M, Romero DA, Barrangou R, Boyaval P, Fremaux C, Horvath P, Magadán AH, Moineau S. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 2010 Nov 4;468(7320):67-71. doi: 10.1038/nature09523. PMID: 21048762.

12. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011 Mar 31;471(7340):602-7. doi: 10.1038/nature09886. PMID: 21455174; PMCID: PMC3070239.

13. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829. Epub 2012 Jun 28. PMID: 22745249; PMCID: PMC6286148.

14. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23. doi: 10.1126/science.1231143. Epub 2013 Jan 3. PMID: 23287718; PMCID: PMC3795411.

15. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6. doi: 10.1126/science.1232033. Epub 2013 Jan 3. PMID: 23287722; PMCID: PMC3712628.

16. Pennisi E. The CRISPR craze. Science. 2013 Aug 23;341(6148):833-6. doi: 10.1126/science.341.6148.833. PMID: 23970676.

17. Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D, Li J. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 2013 Dec 5;13(6):659-62. doi: 10.1016/j.stem.2013.10.016. PMID: 24315440.

18. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71. doi: 10.1016/j.cell.2015.09.038. Epub 2015 Sep 25. PMID: 26422227; PMCID: PMC4638220.

19. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018 Apr 27;360(6387):439-444. doi: 10.1126/science.aaq0179. Epub 2018 Feb 15. PMID: 29449508; PMCID: PMC5961727.

20. Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Franklin B, Kellner MJ, Joung J, Zhang F. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 2017 Nov 24;358(6366):1019-1027. doi: 10.1126/science.aaq0180. Epub 2017 Oct 25. PMID: 29070703; PMCID: PMC5793859.

21. Long C, Amoasii L, Mireault AA, McAnally JR, Li H, Sanchez-Ortiz E, Bhattacharyya S, Shelton JM, Bassel-Duby R, Olson EN. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 2016 Jan 22;351(6271):400-3. doi: 10.1126/science.aad5725. Epub 2015 Dec 31. PMID: 26721683; PMCID: PMC4760628.

22. Ridler C. CRISPR therapy shows promise in Duchenne muscular dystrophy. Nat Rev Neurol. 2018 Nov;14(11):632-633. doi: 10.1038/s41582-018-0078-8. PMID: 30237553.

23. Burr ML, Sparbier CE, Chan YC, Williamson JC, Woods K, Beavis PA, Lam EYN, Henderson MA, Bell CC, Stolzenburg S, Gilan O, Bloor S, Noori T, Morgens DW, Bassik MC, Neeson PJ, Behren A, Darcy PK, Dawson SJ, Voskoboinik I, Trapani JA, Cebon J, Lehner PJ, Dawson MA. CMTM6 maintains the expression of PD-L1 and regulates anti-tumour immunity. Nature. 2017 Sep 7;549(7670):101-105. doi: 10.1038/nature23643. Epub 2017 Aug 16. PMID: 28813417; PMCID: PMC5706633.

24. Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27;360(6387):436-439. doi: 10.1126/science.aar6245. Epub 2018 Feb 15. PMID: 29449511; PMCID: PMC6628903.

25. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, Verdine V, Donghia N, Daringer NM, Freije CA, Myhrvold C, Bhattacharyya RP, Livny J, Regev A, Koonin EV, Hung DT, Sabeti PC, Collins JJ, Zhang F. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017 Apr 28;356(6336):438-442. doi: 10.1126/science.aam9321. Epub 2017 Apr 13. PMID: 28408723; PMCID: PMC5526198.