大部分人對生物學研究的印象基本都來源於科幻電影:科學傢闖禍,人類大難臨頭,英雄拯救地球。2020年,災難真的來瞭,新冠疫情席卷全球,病毒學傢究竟在忙什麼?抗擊疫情,病毒學傢有什麼獨門秘籍嗎?病毒能致病,病毒也能治病嗎?今天的文章就將帶你瞭解病毒的研究及應用。

撰文 | 李慶超(山東師范大學)

病毒是導致人類疾病的一類重要病原體。早在還不知道什麼是病毒的時候,人類就已經想方設法對付病毒瞭。中國人明朝就開始使用人痘預防天花,1798年,英國醫生詹納發明瞭使用牛痘作為疫苗預防天花的方法。

1885年,法國科學傢巴斯德發明瞭狂犬病疫苗。

1892年人類發現瞭第一種病毒——煙草花葉病毒,這種病毒比細菌小,能讓植物生病。

1898年發現瞭首個動物病毒——感染牛羊的口蹄疫病毒。

1901年發現瞭首個人類病毒——通過蚊子傳播的黃熱病病毒。

1911年發現瞭可以導致雞腫瘤的勞氏肉瘤病毒(圖1)。

圖1. 病毒學發展的一些重要節點(來源:wikipedia等)

後來,人們對病毒的認識越來越深刻,病毒研究成為一門單獨的學科:病毒學(圖2)。和一般人想象的不同,病毒學研究除瞭回答基礎的科學問題、預防和治療病毒病之外,還涉及開發和利用病毒。而這三種功能都離不開最重要的病毒研究工具:反向遺傳操作系統。這一系統,可以說是病毒學傢的“毒門秘籍”瞭。

圖2. 病毒學研究的主要內容及相關學科(作者作圖)。包括病毒的結構、分類和演化;病毒的復制過程;病毒與宿主的相互作用及致病、致癌性;病毒研究技術(如病毒分離和培養)

第一步:病毒檢測病毒學研究的第一步是病毒檢測。

已知病毒的檢測,主要應用於醫學診斷和流行病學調查,采用的檢測方法主要有癥狀診斷、免疫學檢測、核酸檢測以及一些凝血實驗等特異性反應的檢測。

對於未知病毒,則需要通過分離、培養、鑒定的過程去發現,最後可以通過電子顯微鏡來直接觀察病毒。但最終要通過測序的手段拿到病毒的基因組序列。這是因為,病毒的基因組序列是其最核心的組分,抓住瞭病毒的基因組序列,就等於找到瞭病毒。

今天的科技迅猛發展,科研人員采用深度測序技術(圖3),很容易就能發現大量新的病毒。對於疑似感染未知病原體的病人,我們可以在恰當的部位采樣,提取核酸,構建文庫,並進行深度測序。測序之後,通過生物信息的方法尋找其中的病原體序列,並給出鑒定結果。

圖3. 深度測序檢測新病毒,https://www.mgitech.cn/news/caseinfo/12/

放大招:“毒”門秘籍找到病毒之後接下來怎麼開展研究呢?接下來,我們就來介紹病毒學傢所使用的最重要的研究工具:反向遺傳操作系統。

01 遺傳學及反向遺傳學

為瞭瞭解反向遺傳學,需要先瞭解一下遺傳學。觀察生物體,我們可以發現一些結構、功能方面的特征,比方說頭發、皮膚、瞳孔的顏色,這些稱之為表現型,也叫表型。表現型是由生物體的基因組所決定的,而生物個體的全部基因組合就總稱為基因型(圖4)。基因型決定瞭表型,而表型反映瞭基因型。

一開始,人們並不知道遺傳的本質,因此最初是從表型出發來研究遺傳學的相關問題的。孟德爾使用豌豆、摩爾根使用果蠅來研究遺傳學,他們通過豌豆的紅花、白花或者說果蠅的紅眼、白眼這種表型來尋找遺傳規律,並定位表型相關的基因。因此,經典的遺傳學是從表型出發來研究基因型的,這就是正向遺傳學。

圖4. 表現型及基因型

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042698901002620

https://www.niaid.nih.gov/diseases-conditions/pidds-genetics-inheritance

在正向遺傳學中,需要通過自然突變或誘變的方式,篩選具有特殊表型的突變體,然後再定位是哪個基因決定瞭這個表型,並且研究該基因的功能。

在反向遺傳學中,科學傢拿到一個未知的基因,可以主動對這個基因進行突變或者改變它的表達量(過表達、低表達或敲除不表達),再去觀察基因突變或基因表達量的變化引起瞭什麼樣的表型變化,並與野生型(沒有經過人為改變的正常基因型)的表型進行比較,從而推測基因的功能。因此,反向遺傳學是通過改變基因型,觀察表型改變的結果,來研究基因的功能(圖5)。

圖5. 正向遺傳學及反向遺傳學

02 反向遺傳學的必備條件是基因工程技術

根據概念,我們不難看出,反向遺傳學中,需要對特定的核酸序列進行改造,而這種改造的技術,實際上是我們認識瞭DNA這種遺傳物質的結構和功能,發展瞭多種基因工程工具酶或者基因工程手段之後,才得以實現的。基因工程是利用生物技術對生物體基因進行直接操縱的、改變細胞的遺傳組成的技術。因此反向遺傳學的思路,要比經典遺傳學的思路出現得晚。

DNA是細胞生物的遺傳物質,它比RNA要穩定,而且大多數基因工程的工具酶作用對象是DNA,因此遺傳物質的改造主要是在DNA上進行的。我們進行遺傳物質改造,主要是在質粒(圖6)上完成的,因為質粒是一種基因組外的、可以獨立復制的遊離DNA,其擴增比較方便,可以在細菌或酵母中進行。(詳細瞭解質粒,前往返樸閱讀《啥是質粒?從生物武器到轉基因食物都跟它有關》)

圖6. 質粒

(來源:https://www.genome.gov/genetics-glossary/Plasmid)

03 感染性克隆

病毒的基因組通常比較小,因此我們可以把病毒基因組的雙鏈接DNA副本組裝在質粒中。把這些帶有病毒序列的質粒DNA,或者由質粒指導轉錄產生的RNA送進細胞——這個過程叫做“轉染”——可以指導細胞工廠產生病毒蛋白,復制新的病毒基因組,並組裝釋放,產生感染性病毒顆粒。

病毒的基因組可以是DNA,也可以是RNA。DNA病毒的基因組可以擴增、切割之後直接連入質粒;而RNA病毒的基因組,則需要通過RNA指導合成DNA的逆轉錄過程,轉化成DNA之後,再連入質粒。這些攜帶有病毒基因組序列、可以產生感染性病毒顆粒的質粒,就稱作“感染性克隆”。將構建好的感染性克隆轉染到細胞中,或轉錄成RNA之後轉染細胞,就可以產生新的病毒(圖7)。

圖7. 感染性克隆構建及病毒的產生,改編自維基百科

04 反向遺傳操作系統

前面講到,反向遺傳研究的思路就是改變基因序列,從基因型出發研究表型,進而研究基因功能。對病毒也是一樣:構建感染性克隆,對其進行基因工程改造,將改造後的感染性克隆轉入細胞中,就能產生帶有突變的病毒,然後用這些新的病毒去感染細胞或宿主,觀察病毒的復制、宿主的癥狀等表型,就可以研究病毒相關基因的功能(圖8)。這樣一套系統,我們稱之為病毒的反向遺傳操作系統。

圖8. 病毒研究的反向遺傳操作系統,改編自維基百科

以最近發佈的新冠病毒反向遺傳操作系統為例[1]:它是借助酵母獲得感染性克隆的。首先,新冠病毒基因組RNA通過逆轉錄及擴增獲得DNA片段,或者直接合成病毒的DNA版本,然後在酵母中重組合成感染性克隆質粒,提取質粒之後,轉錄合成RNA,RNA轉染細胞之後,就可以產生新冠病毒瞭(圖9)。

圖9. 冠狀病毒感染性克隆[1]

不論是用於研究,還是用於疫苗或者治療,要制作病毒,我們都需要在質粒上進行改造,改造的過程中,就會借助一些酶切位點、篩選標記、以及必要的質粒片段等基因工程工具。同時,我們的病毒序列是從天然的病毒中獲取的,設計和制造感染性克隆過程中,勢必會沿用現有的理論模型以及設計思路,即便是從頭開始人工合成一個新的病毒,也會在密碼子使用頻率等等方面,留下人工痕跡。因此,一個病毒是否是人工合成的,是很容易鑒定出來的。

病毒學研究的應用病毒的反向遺傳操作系統,是病毒學以及相關生命科學領域中非常重要的工具,它可以用於基礎研究,研究病毒中各個基因的功能,也可以用於疫苗開發,還可以將病毒作為載體,裝載上不同的基因序列,用於其他生命科學研究。此外,隨著生命科學的發展,病毒載體用於細胞治療、基因治療以及癌癥治療的前景也越來越光明。

01 基礎研究應用

病毒學的思路及工具在生物學基礎研究中應用廣泛。目前病毒載體廣泛應用於基因的過表達、敲除、敲低、動物模型改造等各個方面。以病毒學研究中的假病毒應用為例(圖10):我們可以使用反向遺傳操作系統的基本方法制作假病毒顆粒,令假病毒顆粒包膜上含有所研究病毒的包膜蛋白,可以用來模擬病毒顆粒的抗原性、被中和及感染早期過程;但是,顆粒內部僅含有缺陷病毒基因組或沒有基因組,因此假病毒不能完成病毒的復制周期,也就不會讓宿主發病。由於安全性比較好,借助假病毒顆粒,我們就可以在生物安全級別相對較低的實驗室內研究一些危險的病毒。

圖10. 假病毒顆粒用於冠狀病毒研究(引自金斯瑞公司)

02 疫苗研發和生產

我們每個人都打過疫苗,大傢可以摸一摸自己胳膊上的疤痕,那是註射卡介苗留下來的。疫苗通過刺激機體產生獲得性免疫保護,從而預防疾病。根據疫苗的組分,可以分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、類毒素、亞單位疫苗、重組蛋白或多肽疫苗,以及病毒載體疫苗、DNA或RNA疫苗等。疫苗需要同時滿足兩個條件:既能刺激機體產生有效的免疫保護,又要不導致疾病。接種疫苗過程,類似一場免疫系統的軍事訓練:在不損傷機體的前提下訓練免疫系統。而所謂的免疫力,實際上就是機體在下次遇到病原時能迅速消滅病原體,讓人(或動物)不發病的能力。

我們看一個反向遺傳操作系統制作疫苗的例子(圖11)。我們知道,流感會發生頻繁的突變,每年流行的病毒毒株可能都不相同,換瞭“馬甲”之後免疫系統就不認識它瞭。因此我們必須根據當年所流行的病毒株,來生產新的流感疫苗。這時就要用到反向遺傳操作系統:① 我們從臨床中檢測到流行強毒株,獲得它的抗原編碼序列,② 然後通過基因工程的方式,將抗原部分的編碼序列重組到疫苗弱毒株的感染性克隆中;③ 然後我們將這些質粒轉染到細胞內部,就能夠產生帶有強毒株抗原、並且不具有致病性的、弱的新疫苗毒株,就可以用於預防當年所流行的流感。

圖11. 反向遺傳操作系統制作流感疫苗(來源:wikipedia,作者修改)

預防病毒病最有效的方式是研發疫苗。為瞭防控新冠疫情,全球科研人員都在努力研發新型冠狀病毒的疫苗,我國陳薇院士團隊研發的重組新型冠狀病毒疫苗(腺病毒載體)(“Ad5-nCoV”)已經進入 II期臨床試驗。根據名字就可以知道,這個疫苗所使用的病毒載體是腺病毒,腺病毒是一種沒有包膜的DNA病毒,我們將腺病毒中能夠導致疾病的基因以及一些無關的基因刪除掉,然後重組引入新型冠狀病毒的抗原蛋白表達基因,就制作完成瞭以腺病毒載體為基礎的冠狀病毒疫苗。腺病毒載體的特點是高效率、高滴度(滴度是指病毒的濃度)、低致病性,並且不會整合進入宿主細胞染色體,是一種常用的病毒載體。目前國內外的研究者還使用瞭滅活疫苗、亞單位疫苗、假病毒顆粒、痘病毒載體疫苗及納米顆粒疫苗等策略研發疫苗 (圖12)。其中,納米顆粒疫苗是由病毒抗原及自組裝蛋白組分組成的納米顆粒。

圖12. 新冠病毒疫苗研發策略

(來源:https://research.sinica.edu.tw/covid-19-vaccine-academia-sinica/)

03 病毒也能治病

病毒或病毒載體還可以應用於噬菌體治療、細胞治療、基因治療以及癌癥治療和預防。

由於各種抗生素的發現和應用,細菌對人類健康的危害大大降低瞭,但是,抗生素濫用帶來瞭細菌耐藥性的問題,其中有些細菌具有多重抗生素抗性,我們稱之為超級細菌,超級細菌感染是非常危險的、且在醫學上是非常棘手的問題,而噬菌體是可以感染細菌的病毒,因此使用噬菌體來治療耐藥菌感染成為細菌感染治療的思路之一。2015年,加州大學的一對科學傢夫婦在埃及旅遊途中,丈夫Tom Patterson感染瞭超級細菌,生命垂危,後來使用噬菌體治療才得以康復(圖13)。

圖13. 噬菌體治療超級細菌感染

https://www.bbc.com/zhongwen/simp/world-50336647

癌癥是一類嚴重威脅人類健康的疾病,而某些病毒可以導致腫瘤的消溶,我們稱之為溶瘤病毒。溶瘤病毒包含腺病毒、痘病毒、甲病毒、新城疫病毒、單純皰疹病毒-1、麻疹病毒等(圖14)。這些病毒經過改造之後,可以用於癌癥治療:一方面不導致疾病,另一方面可以殺死腫瘤細胞。溶瘤病毒治療腫瘤的機制有多種,比如破壞腫瘤血管,切斷腫瘤營養來源,直接殺死腫瘤細胞,或者誘導針對腫瘤的細胞免疫反應等等。

圖14. 溶瘤病毒及其作用機制[2]

人體內的免疫系統就像一支軍隊,可以抵禦外來病原體的入侵,同時也可以識別並消滅異常的“叛變”細胞,而有些細胞可以躲過這種監視,不被免疫系統所識別和清除,肆意生長,這就是癌細胞。細胞治療的方法可以借助慢病毒載體,給免疫系統的士兵——T細胞——安裝上能夠識別癌細胞的受體CAR,幫助免疫系統識別並消滅腫瘤(圖15)。慢病毒載體是改造HIV病毒而來的,它的感染效率高,可以將外源基因穩定地插入到細胞基因組中,在細胞治療中應用廣泛。

圖15. CAR-T細胞治療

隨著基因編輯技術的迅猛發展,基因治療的前景越來越被看好。基因治療是通過改造基因來治療或預防疾病的,它采用的方法主要有替換突變基因,敲除有害基因,或者引入新基因。基因治療特別適合治療遺傳病,也可以用於治療病毒病或癌癥。

“蝴蝶男孩”的康復是基因治療的一個經典例子。2017年,一位患有交界型大皰性表皮松解癥的男孩Hassan因全身皮膚嚴重破損而入院,他的皮膚異常脆弱,一碰就破,面臨生命危險。這一種嚴重的遺傳病,是由皮膚的層黏連蛋白基因異常所導致的,人們形象地將這位患病的孩子稱為“蝴蝶男孩”。科學傢把正常的黏連蛋白基因裝載到逆轉錄病毒載體中,然後用病毒感染體外培養的皮膚細胞,這些皮膚細胞被病毒載體引入瞭正常的基因,從而能夠表達正常的蛋白。在體外培養轉基因皮膚後,把皮膚移植到小孩身體上,逐步取代原來的皮膚,達到治療的目的(圖16)。

圖16. 病毒載體制作轉基因皮膚治療交界型大皰性表皮松解癥[3]

脊髓性肌萎縮是一種致死性的遺傳病,患兒的腦幹和脊髓中的運動神經元逐步被破壞,慢慢失去說話、走路的能力,到最後,甚至無法呼吸和吞咽,最終被奪去性命。研究發現這種疾病是SMN1基因異常造成的,美國諾華公司開發的腺病毒相關病毒載體可以將正常的SMN1基因裝到病患的基因組上,從而治療這種疾病。這種病毒載體藥物隻需要註射一次,而一次的費用高達200萬美元(圖17)。這裡所使用的AAV病毒是復制依賴於腺病毒的缺陷病毒,本身不導致疾病,能夠感染分裂和不分裂的細胞(神經細胞通常不分裂),可以定點整合到人19號染色體上,是一種常用的病毒載體。

圖17. 史上最貴藥物,用於治療脊髓性肌萎縮的AAV病毒

結 語病毒是導致人類疾病的重要病原體,從古到今,各種病毒都是人類的夢魘,即便是當今社會,面臨新冠疫情,人類健康、經濟、社會各方面依然受到極大的沖擊。隨著人與自然的邊界愈加模糊,氣候環境劇烈變遷,人或動物的國際交流運輸頻繁,新發病毒病永遠是、而且越來越是一種極其可能發生、且已經或正在發生的、對人類社會的嚴重威脅。

病毒學研究讓我們在新發病毒病預警、處置和防疫方面有瞭長足的進步,我們發現新病毒的速度越來越快,做出有效防疫措施和決策越來越快,藥物和疫苗研發也越來越快。相較歷史上的歷次瘟疫,人類社會應對傳染病的能力已經今非昔比。同時,病毒學研究也為生命科學基礎研究、醫學研究帶來瞭很多令人矚目的成果。我們常說,21世紀是生命科學的世紀,很多專傢也把基因編輯為代表的生命科學技術作為第四次工業革命的主要組成部分,而這一切離不開病毒學工具。因此,病毒學研究不論從生命科學發展還是人類健康事業來說,都是非常重要的。

參考文獻

[1] https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.21.959817v1.full.pdf

[2] Ungerechts, G., Bossow, S., Leuchs, B., Holm, P.S., Rommelaere, J., Coffey, M., Coffin, R., Bell, J., and Nettelbeck, D.M. (2016). Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development 3, 16018–13.

[3] https://www.nature.com/articles/nature24753

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